色谱方法开发通常耗时且费力。大家常采用的方法是，用已经习惯使用的溶剂、pH条件、缓冲盐、以及常用色谱柱的组合，作为起始条件，然后对流动相的比例进行一系列的调整，直至获得比较满意的峰形与分离。但这样的工作方式，通常极为耗时，而且也并不能获得最佳分离条件。更为系统性的方法策略，是利用好的实验设计，并遵循以下流程，进行高效、高质量的反相色谱方法开发。这个方法开发流程包括：1.方法筛选：流动相pH、有机溶剂、以及色谱柱，作为对选择性影响最大、因而也是最重要的条件因素，首先被加以筛选。2.方法优化：对以上得到的所有结果，评估这三个因素的何种组合，获得了最佳分离效果。在这个组合条件的基础上，进行优化或微调，以获得最终想要的结果。3.方法验证：对最终的方法进行验证，检查它是否满足预期的分离效果与分析目的。
方法筛选的影响因素：1.PH的影响：当分析物含有可电离官能团时（可电离官能团指，在不同的pH条件下可处于不同程度的电离状态，例如：伯/仲/叔胺基、羧酸基、酚酸基），pH条件将强烈影响分析物的反相保留效果，pH条件的改变也会造成最强烈的选择性改变效果。酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反相保留最大，中性化合物的保留不受pH影响。PH的选择与色谱柱的选择——对于帕罗西汀和它的有关物质B、D、G、F，因其胺基结构在不同pH条件下电离状态不同，使用pH 10条件比pH 3条件能够获得更强的保留和更好的分离选择性。由于具有更高分辨率和更好的选择性，pH 10是适合被测物的pH值。下一步是评估在相同pH 10值下三种不同色谱柱的色谱图，以选择具有最佳分辨率的色谱柱。三种色谱柱都显示了可检测所有组分的能力，由于C18的通用性，因此选择BEH C18色谱柱来对比不同有机改性剂的选择性。2. 色谱柱的影响: 在选择色谱柱进行分析方法开发时，应充分认识，色谱填料基质(硅胶颗粒、杂化颗粒、聚合物颗粒)因其化学性质不同而会提供不同的保留与选择效果。在传统的HPLC系统上，随着可变的pH值和有机溶剂的组合，筛选一系列的色谱柱，会花费大量的时间。使用ACQUITY UPLC色谱柱管理器、高分辨的亚2 μm短柱，配合ACQUITY UPLC系统，将大大缩短这个过程，从以往的数天时间减少到数小时。3.有机溶剂的影响:甲醇和乙腈，是用于反相分离的典型有机溶剂。除了洗脱强度、粘度(与柱背压有关)、紫外吸收性不同，甲醇与乙腈在化学选择性上也有所不同，甲醇可以发生氢键作用，因此会提供显著不同的选择性。甲醇，洗脱能力较弱，质子化溶剂，提供氢键作用；乙腈，非质子化溶剂，洗脱能力较强，粘度较低（柱背压更低）。
方法优化：有几个参数可以用来调整或优化色谱分离效果。梯度斜率是一个用来操作以控制保留和选择性的物理参数。但是，梯度斜率经常在分离度和灵敏度之间做平衡考量。另外一个可以优化的参数是温度。每个化学过程都受温度影响，温度可以提供明显的不同选择性。色谱方法开发：当有关物质浓度降低时，有关物质B和D与主峰帕罗西汀的分离度明显减少。这是由于组分与帕罗西汀峰的不同浓度水平造成。这时需要进一步的优化。1.方法优化与梯度斜率：更缓的梯度斜率可以提高分离度，降低梯度斜率将降低灵敏度；更陡的梯度斜率可能压缩色谱峰，经常会导致分离度的降低，增加梯度斜率将增加灵敏度；改变梯度斜率时要平衡峰高与分离度的关系；改变保留与选择性。2.方法优化与温度：减少流动相粘度；降低背压，如果流速保持常数；提高分析物的扩散，更高的优化线速度；改变保留与选择性；温度会影响中间的每一个化学过程，例如增加温度会降低移动相的粘度，如果流动速度恒定将导致系统背压降低，高温将改变固定相和流动相之间的分配速率，然而由于提高了被测物分散性，会加快优化线性速度。对温度变化敏感的化合物，温度的微小变化都会导致选择性发生独特变化。
方法验证提示：方法验证用于确认分析方法的特性能否满足应用要求，验证过程中需要评估的典型色谱法特性是专属性、线性、范围、检测限、定量限、准确度、精度、稳定性。分析方法验证经常是由多个步骤组成的反复人工过程，需要进行大量的色谱测试，以充分评估所有八种特性，审视、计算和管理这些过程获得的所有数据可能具有一定的难度。Empower方法验证管理器采用自动化的验证过程，使数据审视更加顺畅，极大提高了验证过程的效率和可靠性。总之，通过使用包括摸索试验和验证的方法可明显提高色谱测试方法的开发效率。设计试验研究包括影响选择性的多个参数，例如固定相、pH值、有机改性剂，自动化运行极大加速了测试方法开发流程。合理审视数据后，完成最终测试方法经常是微调和优化如梯度坡度和温度等变量的过程。为了保证所开发的方法能够满足应用要求，需要使用前面确定的性能参数对方法进行验证。
客服一
