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在色谱分析中，流动相必不可少，那么问题来了，如何选择流动相？当然，要看所要检测样品的性质了，高效液相根据色谱柱的不同分为反相和正相，常用的C18柱、C8柱为反相柱，一般反相是首选，流动相的极性大于色谱柱的极性，流动相由极性较大的水和极性较小的有机溶剂（常用的是乙腈、甲醇）按照一定的比例配制而成。当样品为强亲水性样品时，流动相中含水时，在色谱柱上保留很弱，需采用非水反相色谱。当样品为强疏水性样品时，流动相中含水时，在色谱柱上保留很强，需采用正相色谱。正相色谱时，流动相比例极性小于色谱柱的极性，流动相由非极性的正己烷和极性较大的有机溶剂（二氯甲烷、丙醇、异丙醇、甲基叔丁基醚等等）按照一定的比例配制而成。
　　
流动相选择秘诀1：由强到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。秘诀2：三倍规则：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。秘诀3：粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。
　　
常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈，甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度;乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈，甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度;乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性，所以我们一般倾向于多用乙腈，少用甲醇。但是有时候样品峰形不好或者分离不好，更换溶剂试试是一个很好的选择，毕竟不同的溶剂提供不同的选择性。
　　
对流动相的优化主要在水相上下功夫，水里可以加酸、加碱、加盐，从而改善峰形、提高分离度。流动相里加碱的情况比较少，主要还是加酸，常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等，其中最常用的是磷酸和三氟乙酸，磷酸在低波长下没有紫外吸收，而三氟乙酸在低波长下有，但是三氟乙酸易挥发而磷酸不行，所以单纯做液相，低波长下磷酸最合适，三氟乙酸有吸收，运行梯度时基线漂移很严重，而做液质就要考虑首选三氟乙酸了，近些年还比较流行加甲酸或乙酸。一般情况下这几种酸没有太大区别，我们更多的是考虑通过加酸改变流动相的pH值，从而改善样品的分离度和峰形。
　　
相同进样量样品峰越高则意味着峰形越好，从图中可以看出多数样品在低pH值下峰形都比中性要好，这个主要是由色谱柱本身的性质所决定的。色谱柱主要都是硅胶基质，现有的填料处理工艺无法将硅胶上残余的硅羟基全部去除，硅羟基会造成样品峰拖尾，一般认为硅羟基的pKa在3.5到4.5之间，低pH值能帮助抑制硅羟基的活性，减小拖尾，从而改善峰形，提高分离度。水溶液中添加0.1%(体积)的磷酸或者三氟乙酸其pH值大概在2左右，用作流动相正好抑制硅羟基的活性，所以开发液相分析方法时流动相首选水加01.%的磷酸，然后再以此为基础做优化。
　　
在单独用酸不行的时候就要考虑使用缓冲盐，缓冲盐的选择原则是：简单、稳定、缓冲能力强、配制简单，需要调pH值时要有相应的酸或碱。常用的缓冲盐是磷酸盐，主要是钾盐和钠盐，再有就是醋酸盐，常用的盐浓度在10~20mM左右。以前因为色谱柱填料生产工艺的问题，往往需要在流动相里添加三乙胺来减少拖尾，但是三乙胺对色谱柱的寿命有很大影响，现在新的色谱柱都不再需要了。流动相里有时会需要调节pH值到碱性，具体pH要视色谱柱的耐受范围而定，常用 NaOH、KOH溶液或氨水做为调节缓冲盐溶液碱性pH的试剂，也可以往水里单独添加氨水做碱性流动相。